Expression von AC133 vs. CD34 bei akuten Leukämien im Kindesalter[*]

Zusammenfassung:

AC133, ein neu entdecktes Stammzellantigen mit 5-transmembranen Domänen wird von 30 - 60 % aller CD34⁺-Zellen exprimiert. Wir haben uns daher zum Ziel gesetzt, zu untersuchen, ob und in welchem Ausmaß humane Stamm-/Progenitorzellen (HSPZ) des Nabelschnurblutes (NSB) sowie des peripheren Blutes (PB) vor oder nach G-CSF-Stimulation AC133 exprimieren. Schwerpunktmäßig haben wir Knochenmark-(KM)-Proben von akuten Leukämien zum Zeitpunkt der Erstdiagnose im Rezidiv und auch während einer kompletten Remission analysiert.

Die Expressionsanalysen wurden flowzytometrisch durchgeführt, wobei spezifische monoklonale Antikörper (AC133/1 und AC133/2 der Fa. Miltenyi Biotec GmbH) in Kombination mit dem Antikörper gegen CD34 (HPCA-2 der Fa. Becton Dickinson) verwendet wurden.

In bisherigen Untersuchungen haben wir im NSB von 43 Proben einen durchschnittlichen Anteil von 0,294 ± 0,165 % AC133⁺- vs. 0,327 ± 0,156 % CD34⁺-HSPZ gemessen. Im PB von 11 Probanden konnten max. 0,15 % CD34⁺- und auch AC133⁺-HSPZ nachgewiesen werden. Deutlich höher lag die Stammzellkonzentration im PB von Kindern mit unterschiedlichen Erkrankungen (Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, ALL/AML), die für eine periphere Blutstammzelltransplantation (PBSZT) mit rhG-CSF vorbereitet worden waren. Es konnten bis zu 3,51 % AC133⁺-Zellen ermittelt werden, geringfügig höhere Werte (3,94 %) wurden für CD34⁺ festgestellt.

An insgesamt 128 KM-Proben haben wir AC133⁺- als auch CD34⁺-Zellen quantifiziert. 10 von diesen KM-Proben stammten von Patienten, bei denen eine Neoplasie nicht nachgewiesen werden konnte. Die CD34⁺-Zellen lagen zwischen 0,03 - 1,49 %; etwas geringer (bis 0,64 %) waren die Werte für AC133. KM-Proben von 53 Kindern mit akuter Leukämie wurden bei Erstdiagnose (41 ALL/12 AML) phänotypisiert und die Leukämieblasten auf AC133- und CD34-Expression überprüft. 32/41 (78 %) der lymphatischen Leukämieblasten waren CD34-positiv und 24/41 (58 %) exprimierten AC133. Interessanterweise konnten wir bei zwei Proben von ALL-Patienten eine AC133-Expression feststellen, jedoch keine CD34-Antigene. 42 % (5/12) der AML-Blasten exprimierten CD34 und nur 25 % (3/12) das Antigen AC133. Ähnliche Werte erhielten wir in der Rezidivgruppe (n=18). In der Gruppe der Leukämien, bei denen zum Zeitpunkt der Untersuchung eine Remission vorlag (n=47), konnten bis zu 5,55 % CD34⁺- und bis zu 1,25 % AC133-positive HSPZ ermittelt werden. Diese relativ hohen Werte dürften auf eine z. T. bestehende rhG-CSF-Stimulation zur rascheren Überwindung einer Aplasie zurückzuführen sein.

Aus unseren bisherigen Ergebnissen folgern wir, dass es sinnvoll erscheint, Quantifizierungen von CD34⁺-HSPZ durch den Nachweis von AC133 zu ergänzen. Dieser neue Stammzellmarker könnte im Rahmen einer autologen PBSZT als eine mögliche Alternative zu CD34 bei Verwendung einer MACS-Selektion in Betracht gezogen werden. AC133-negative Leukämien könnten im Falle eines unzureichenden Ansprechens auf die protokollgemäße Chemotherapie ebenfalls von einer PBSZT profitieren.

Abkürzungen:

AA Aplastische Anämie

ALL Akute Lymphoblastische Leukämie

AML Akute Myeloische Leukämie

CD Cluster of Differentiation

HSPZ Hämatopoetische Stamm- u. Progenitor-Zellen

KM Knochenmark

MNZ Mononukleäre ZellennAnzahl

NSB Nabelschnurblut

PB Peripheres Blut

PBSZT Periphere Blutstammzell-Transplantation

rhG-CSF rekombinanter humaner Granulozyten-Kolonie-Stimulierender Faktor

AC133, a newly discovered antigen on human progenitor cells, demonstrating 5-transmembraneous domains is expressed by 30 - 60 % out of all CD34⁺ cells. Our aim therefore was to investigate the extent of human stem-/progenitor cells expressing AC133 antigen in umbilical cord blood, peripheral blood without or following an application of granulocyte-colony stimulating factor (rhG-CSF). The main task was the investigation of bone marrow aspirates derived from children suffering from newly diagnosed acute leukemias, as well as from patients with a relapse or during a complete remission. The determination of antigen expression was done by application of flow cytometry (FACScan analysis) and the usage of newly developed monoclonal antibodies (AC133/1 and AC133/2; Miltenyi Biotec GmbH) in combination with monoclonal antibody directed against CD34-antigens (HPCA-2; BD).

Our studies till now show average percentages in umbilical cord blood derived from 43 newborns about 0.294 ± 0.165 % AC133⁺ vs. 0.327 ± 0.156 % CD34⁺ hematopoietic stem-/progenitor cells (HSPC). In peripheral blood from 11 healthy donors we verified up to 0.15 % CD34⁺ as well as AC133⁺ HSPC's. The concentration of progenitor cells was found to be obviously higher in peripheral blood from children with various diseases (neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, ALL/AML) and undergoing application with rhG-CSF in order to be prepared for PBSC-transplantation. In those cases we found up to 3.51 % AC133⁺ cells as well as slightly higher values (3.94 %) for CD34 antigens.

Additionally we quantified 128 bone marrow (BM) samples for AC133⁺ and CD34⁺ cells. In 10 BM samples, derived from patients without any neoplasia, the CD34⁺ cells were about 0.03 % and 1.49 %, whereas AC133 values were up to 0.64 %. Bone marrow aspirates from 53 children with acute leukemias at time of diagnosis (ALL: n=41/AML: n=12) have been immunophenotyped and leukemic blast cells have been proved for AC133- and CD34 antigen expression. 32/41 (78 %) of lymphoblastic leukemic cells showed to be positive for CD34 antigen and 24/41 (58 %) demonstrated AC133 antigens. Interestingly there were 2 ALL-patients with pathological blast cells positive for AC133 but lacking of any CD34 antigens. 42 % (5/12) of investigated AML patients showed CD34⁺ phenotype, on the other hand there were only 25 % (3/12) with AC133⁺ phenotype. Similar values were found in relapsed patients (n=18). In BM samples from patients during complete remission (n=47) we could detect percentages up to 5.55 % for CD34 and up to 1.25 % for AC133 positive stem-/progenitor cells. Such quite high data may be explained by occasionally application of rhG-CSF therapy.

Our results till now lead to the conclusion, that it seems to be useful, to recruit quantification of CD34⁺ HPSC by additionally detecting AC133 antigens. This new stem cell marker (AC133) maybe of great value in case of autologous peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) because it could be an alternative to the usual CD34⁺ MACS selection system.

Schlüsselwörter:

AC133 - ALL - AML - CD34 - hämatopoetische Stamm-/Progenitorzellen - Nabelschnurblut - autologe periphere Blutstammzelltransplantation - rhG-CSF - FACS-Analysen

Key words:

AC133 - ALL - AML - CD34 - hematopoietic stem-/precursor cell - umbilical cord blood - autologous peripheral blood stem cell transplantation - rhG-CSF - FACS-analysis

1 Unserem verehrten Chef, Herrn Professor Dr. med. Dr. h. c. Bernhard Kornhuber, gewidmet

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1 Unserem verehrten Chef, Herrn Professor Dr. med. Dr. h. c. Bernhard Kornhuber, gewidmet

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