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DOI: 10.1055/s-0039-1688285
Eine neue, duale Reporterzelllinie zur Darstellung SOX9-positiver Progenitoren hergestellt aus humanen embryonalen Stammzellen
Publication History
Publication Date:
07 May 2019 (online)
Einleitung:
Der Transkriptionsfaktor SOX9 ist an der Organogenese des Pankreas beteiligt und kontrolliert vermutlich den Pool von NGN-3 positiven Zellen und damit die endokrine Entwicklung des Pankreas. Um die Rolle von SOX9 zu analysieren, sollte eine neue humane embryonale Stammzelllinie mit einem Reporter-knock-in in den SOX9-Lokus erstellt werden.
Ergebnisse:
Zu diesem Zweck wurde ein knock-in der Reportergene H-2KK und GFP2, vermittelt durch CRISPR/Cas9 und homologe Rekombination, in den SOX9-Lokus durchgeführt. Von 48 generierten Klonen zeigten 32 eine homozygote Integration und 7 eine heterozygote Integration. Alle getesteten Klone aktivierten GFP2 nach Differenzierung in Richtung insulinproduzierender Zellen. Der Klon HES3 SC30 zeigte 50–60% GFP2-positive Zellen nach 12–13 Tagen Differenzierung. FACS-sortierte GFP2-positive Zellen exprimierten SOX9, PDX1, HNF6 und NKX6.1 aber kein NGN3, während GFP2-negative Zellen überwiegend negativ für diese Marker blieben. Neben dem Reporter GFP2 exprimierten diese Zellen auch das Oberflächenantigen H-2KK, welches eine Zellsortierung mittels MACS ermöglichte. Die weitere Differenzierung der SOX9/H-2KK/GFP2-positiven Zellen zeigte, dass diese effizient in Insulin/C-Peptid-positive und Glucagon-positive Zellen differenziert werden können.
Schlussfolgerungen:
Diese Studie berichtet von der Generierung einer neuen Reporterzelllinie, in welcher ein konservativer knock-in der Reporter H-2KK und GFP unter Wahrung der Funktion des SOX9-Lokus erfolgt ist. Die beiden Reportergene ermöglichen die FACS- oder MACS-basierte Aufreinigung von SOX9-positiven Zellen. Diese exprimieren alle wesentlichen Marker multipotenter, pankreatischer Progenitorzellen. Außerdem differenzieren SOX9-positive Zellen effizient in Inselzellen. Diese Zelllinie ist ein neues Hilfsmittel, welches sowohl das Studium der humanen pankreatischen Entwicklung, als auch die Aufreinigung von Progenitorzellen zum Zwecke der Therapie eines Diabetes ermöglichen kann.