Induktion des Autophagie-assoziierten Zelltodes durch Histon-Deacetylase Inhibition in pankreatischen neuroendokrinen Tumorzellsphäroiden

Einleitung:

Die Inzidenz neuroendokriner Tumore des Pankreas (PNET) stieg in den letzten Jahren. Neben der chirurgischen Resektion und palliativen Therapie wurde noch keine effektive Therapie entwickelt.

Ziele:

In diesem Projekt wird die Rolle der Autophagie und seine Mechanismen, insbesondere die Induktion des Autophagie-assoziierten Zelltodes, in pankreatischen neuroendokrinen Tumorzellsphäroiden und pankreatischen Sternzellsphäroiden untersucht.

Methodik:

In BON1, HMEG2725 (PNET), HPSC2.2 (Human pancreatic stellate cells) Sphäroiden werden Autophagiemarker nach 72h Behandlung mit 100pM Bafilomycin (v-ATPase Inhibitor) und 10nM Panobinostat (Histon-Deacetylase Inhibitor) durch Western Blot und RT-qPCR bestimmt. Bestimmung der Autophagieaktivität in GFP-RFP-LC3B transfizierten BON1 und HPSC2.2 durch Fluoreszenzmikroskopie nach Behandlung.

Ergebnisse:

BON1 und HMEG Sphäroide zeigen unter Panobinostat eine signifikant erhöhte Expression der Autophagie-Markertranskripte BECN1, MAP1LC3B, SQSTM1, UVRAG, TFEB und PRKAA. In HPSC Sphäroiden verursacht Panobinostat eine Senkung der BECN1 und TFEB Transkripte. Unter Bafilomycin ist die Markerexpression in BON1, HMEG und HPSC stabil. BON1 zeigt eine schwache p-AMPK Expression, die unter Panobinostat noch weiter gesenkt ist. Bei HMEG wird durch Panobinostat sowohl p-AMPK als auch AMPK vermindert. HPSC zeigt weder eine Expression von AMPK noch p-AMPK. Panobinostat verursacht in BON1 nur eine Reduktion von MAP1LC3B Protein und in HMEG den Abbau von p62 und eine stark erhöhte UVRAG Proteinexpression. Unter Bafilomycin sind kaum Veränderungen in der Proteinexpression erkennbar, bis auf eine erhöhte p-AMPK-alpha Aktivität in HMEG. Panobinostat verursacht in BON1 eine Senkung/Erhöhung der grün/rot Fluoreszenz, die einen ausgereiften Autophagieprozess zeigt. In HPSC ist diese Fluoreszenzveränderung nicht zu sehen.

Schlussfolgerung:

Autophagie liegt in PNET Sphäroiden basal vor und kann durch Histon-Deacetylasen Inhibition im hohen Maße aktiviert werden und in Autophagie-assoziierten Zelltod übergehen. In HPSC Sphäroiden ist die Autophagie inaktiv und kann nicht durch den Histon-Deacetylasen Inhibitor aktiviert werden.

Der Mechanismus der Autophagie ist in PNETs AMPK-alpha unabhängig und könnte ein Ziel für zukünftige Therapien sein.