Regulation der intestinalen Barrierefunktion und Induktion von Zellzyklus-Arrest durch gram-negative Bakterien: ein in-vitro Modell zur bakteriellen Translokation

Einleitung:

Die spontan Bakterielle Peritonitis (SBP) ist eine Komplikation der Leberzirrhose und entsteht durch Translokation von Bakterien aus dem Darm in die Bauchhöhle und mesenterialen Lymphknoten. Oft finden sich dabei Erreger aus dem gram-negativen Spektrum, wie Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae. Typische Veränderungen, die im Rahmen der Leberzirrhose auftreten, wie eine geschwächte epitheliale Barriere, Veränderungen im Mikrobiom oder eine Immunsuppression begünstigen die bakterielle Translokation (BT). Unsere Vorarbeiten zeigten bereits, dass E. coli in der Lage ist, Zell-Zell-Kontakte zu destabilisieren.

Ziele:

Charakterisierung molekularer Mechanismen, die die Passage gram-negativer Bakterien durch das Epithel ermöglichen.

Methodik:

Humane Darmepithelzellen (Caco-2) wurden für 6 – 15 Tage kultiviert und anschließend mit E. coli oder K. pneumoniae (MOI 0 – 10) für 4 Stunden stimuliert. Hitzeinaktivierte Bakterien und LPS dienten als Kontrolle. Proteasomale Prozesse wurden mithilfe des Inhibitors clasto-Lactacystin β-lactone blockiert. Die Analyse der Zell-Zell-Kontakte (E-Cadherin, Occludin, Claudine) erfolgte durch Western Blot und Immunfluoreszenz. Effekte auf den Zellzyklus wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

Ergebnis:

Bakterielle Koinkubation mit K. pneumoniae führte zu reduzierten Proteinspiegeln von Occludin, Claudin-1 und Claudin-4 in Caco-2 Zellen. In Anwesenheit von E. coli waren die Mengen an Occludin und E-Cadherin vermindert. Dieser Effekt war nach Stimulation mit hitzeinaktivierten Bakterien oder LPS nicht zu beobachten. Eine Blockierung des Proteasoms hatte ebenfalls keine Auswirkung auf die Proteinspiegel von Occludin oder E-Cadherin. Darüber hinaus führte die bakterielle Stimulation im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle zu einem G1 Arrest mit bis zu 11% mehr Zellen in der G0/G1 Phase.

Schlussfolgerung:

Gram-negative Bakterien wie E. coli oder K. pneumoniae sind in der Lage Zell-Zell-Kontakt-Proteine zu regulieren und somit die Integrität des Darmepithels zu destabilisieren. Die Regulation beruht möglicherweise auf einer posttranslationalen Modifikation und setzt die Anwesenheit lebender Bakterien voraus. Der destabilisierende Effekt könnte in Kombination mit der Induktion des Zellzyklus-Arrests die BT begünstigen.