Vergleichende Studien verschiedener Methoden zur Bestimmung von r-Hirudin in vitro

Zusammenfassung

Zur Bestimmung von rekombinantem (r-)Hirudin stehen auf der Gerinnselbildung beruhende, amidolytische, immunologische und physikochemische Techniken zur Verfügung. Die globalen Tests wie PTZ, aPTT und Heptest reagieren nicht ausreichend auf r-Hirudin in dem Bereich von 0,5 bis 10,0 μg/ml, in dem volle Antikoagulation erreicht wird, wie dies aus Thrombosemodellen im Tierversuch hervorgeht. Der Thrombinzeittest mit 10 E/ml war sehr empfindlich auf r-Hirudin, die Kalzium-Thrombin-Gerinnungszeitmit 10 E/ml reagierte dosisabhängig in einem Bereich von 0,15 bis 10,0 μg/ml. Vollblutgerinnungstests wie ACT und Thrombelastographie messen den r-Hirudinspiegel bis 25 μg/ml effektiv. Der amidolytische Anti-Faktor-IIa-Test, spezifisch für die Beurteilung der direkten Thrombinhemmung, war besonders dann sehr effektiv, wenn das Probenvolumen im Verhältnis zur Thrombinkonzentration zur Bestimmung höherer r-Hirudinkonzentrationen vermindert wurde. Dieser Test könnte für die Qualitätskontrolle geeignet sein, da er biochemisch definiert ist und die Reagenzien leicht standardisiert werden können. Thrombinbildungstests auf der Basis synthetischer Substrate zeigten eine nur geringe Wirkung von r-Hirudin; hingegen wiesen Tests, die auf der Bildung von Thrombin-Antithrombin-Komplexen und auf der Bildung von Prothrombinfragment F₁₊₂ beruhen, eine dosisabhängige Reaktion auf. Immunologische Methoden (ELISA) sind in der Entwicklung. Da diese Tests sowohl das gebundene als auch das freie r-Hirudin bestimmen und da sie bereits auf Submikrogrammspiegel empfindlich sind, dürften sie nur für die direkte Bestimmung der absoluten r-Hirudinspiegel, nicht aber für die Überwachung der klinischen Antikoagulation geeignet sein.

• LITERATUR

• 1 Vogel G, Markwardt F. Clinical use of hirudin. Folia Haematol 1988; 115: 113-8.
• 2 Chesebro JH, Heras M, Webster M, Mruk J, Grill D, Fuster V. The critical role of thrombin in arterial thrombosis is demonstrated by hirudin. Angio Archiv 1989; 18: 9.
• 3 Bichler J, Fichtl B, Siebeck M, Fritz H. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of hirudin in man after single subcutaneous and intravenous bolus administration. Arzneimittelforschung 1988; 38: 704-10.
• 4 Markwardt F, Nowak G, Stürzebecher J, Griessbach U, Walsmann P, Vogel G. Pharmacokinetics and anticoagulant effect of hirudin in man. Thromb Haemost 1984; 52: 160-3.
• 5 Chang JY. The functional domain of hirudin, a thrombin-specific inhibitor. FEBS Lett 1983; 164: 307-13.
• 6 Dodt J, Machleidt W, Seemuller U, Maschler R, Fritz H. Isolation and characterization of hirudin isoinhibitors and sequence analysis of hirudin PA. Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367: 803-11.
• 7 Markwardt F. Die Isolierung und chemische Charakterisierung des Hirudins. Hoppe Seylers Physiol Chem 1957; 308: 147-56.
• 8 Markwardt F, Hauptmann J, Nowak G, Klessen C, Walsmann P. Pharmacological studies on the antithrombotic action of hirudin in experimental animals. Thromb Haemost 1982; 47: 225-9.
• 9 Chromogenic hirudin assay. Preliminary product brochure. Boehringer Mannheim Research Institute; Tutzing, FRG.:
• 10 Stone SR, Hofsteenge J. Kinetics of inhibition of thrombin by hirudin. Biochemistry 1986; 25: 4622-8.
• 11 Walenga JM, Pifarre R, Hoppensteadt DA, Fareed J. Development of recombinant hirudin as a therapeutic anticoagulant/antithrombotic agent: Some objective considerations. Semin Thromb Hemost 1990; 15 (03) 316-33.
• 12 Walenga JM, Pifarre R, Fareed J. Recombinant hirudin as an antithrombotic agent. Drugs of the Future 1990; 15 (03) 267-80.
• 13 Walenga JM, Fareed J, Messmore HL. Newer avenues in the monitoring of antithrombotic therapy: The role of automation. Semin Thromb Hemost 1983; 09: 346-54.
• 14 Porta R, Pescador R, Mantovani M, Prino G. Quantitative comparison of recombinant hirudin’s antithrombotic and anticoagulant activities with those of heparin. Thromb Res 1990; 57: 639-43.
• 15 Markwardt F. Development of hirudin as an antithrombotic agent. Semin Thromb Hemost 1990; 15 (03) 269-82.
• 16 Fareed J, Hoppensteadt D, Coker S, Calabria R, Birdsong B, Walenga JM. Comparative studies on the anticoagulant and antiprotease actions of a synthetic tripeptide (D-MePhe-Pro-Arg-H), recombinant hirudin and heparin. Implications in the development of newer antithrombotic drugs. Blood 1990; 76 (10) (Suppl. 01) 420a.
• 17 Spinner S, Stoffler G, Fink E. Quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for hirudin. J Immunol Method 1988; 87: 79-83.
• 18 Enzyme linked immunoassay for recombinant hirudin. Preliminary product brochure. Serbio Paris, France.:
• 19 Walenga JM, Bakhos M, Messmore HL, Fareed J, Pifarre R. The potential use of recombinant hirudin as an anticoagulant in a cardiopulmonary bypass model. Annals Thorac Surg 1991; 51: 271-7.