Charakterisierung von p73 als neuer Transaktivator des IGFBP4-Gens beim hepatozellulären Karzinom

Einleitung:

Die p53 Familienmitglieder p53, p63 und p73 sind an der Regulation von Zellzyklus, Seneszenz und Apoptose beteiligt. In ihrer Funktion als Transkriptionsfaktoren und abhängig von ihrer jeweiligen Splicevariante – mit Transaktivierungsdomäne (TA)/dominant negativ (DN) – aktivieren oder inhibieren sie spezifische Zielgene. In Vorarbeiten wurde das Gen für Insulin-like growth factor binding protein 4 (IGFBP4) als potentielles Zielgen der p53-Familie mit prognostischer Relevanz im hepatozellulären Karzinom (HCC) identifiziert. Im Gegensatz zu p53 ist das IGF-System an der Regulation von Wachstum und Zellüberleben beteiligt. IGFBP4 wirkt als Inhibitor, der proliferative IGF-Effekte limitiert und in dieser Funktion möglicherweise mit p53-Proteinen interagiert.

Ziel:

Charakterisierung des regulatorischen Einflusses der p53-Familie auf IGFBP4.

Methodik:

Hep3B-Zellen wurden mit rAd-p53, -TAp73 und -DNp63 transfiziert. mRNA-Mengen von IGFBP4 wurde mittels qPCR bestimmt, IGFBP4 Proteinmengen mittels Western Blot und ELISA ermittelt. Zur Identifikation potentieller Bindungstellen (BS) für p53-Proteine im IGFBP4 Lokus wurde eine TRANSFAC Datenbankanalyse durchgeführt. Die so identifizierten Sequenzen wurden kloniert, deletiert und in Luziferase-Reporterassays analysiert, um die Bindung von p53-Proteinen zu evaluieren.

Ergebnisse:

Die IGFBP4 Expression war mit TAp73 über 30-fach, mit DNp63 über 15-fach und mit p53 3-fach erhöht. Eine Induktion von intrazellulärem IGFBP4-Protein wurde in allen transfizierten Zellen beobachtet, während extrazelluläres IGFBP4 nur mit TAp73 und DNp63 nachweisbar war. Im Intron 1 des IGFBP4-Gens wurden zwei putative p73-BS identifiziert. Die Intron1-abhängige Luziferaseaktivität war mit TAp73 mehr als 20-fach erhöht. Diese Induktion war nach Deletion einer der putativen BS um über 70% reduziert.

Schlussfolgerung:

Erstmals zeigen wir die Wechselwirkung von TAp73 und dessen Zielgen IGFBP4 beim HCC und damit eine bisher unbekannte Assoziation des Netzwerks der p53 Familie und der IGF Signaltransduktion. Da wir in Vorarbeiten bereits IGFBP2 als neues Zielgen der p53-Familie identifizierten, unterstreichen diese Ergebnisse die Verbindung zwischen tumorinhibierenden Mechanismen durch die p53 Familie und IFG-abhängiger Zellproliferation.