Virus-Wirt-Interaktion – Hepatitis B Virus, HBx und 3D-Zellkernarchitektur: Chromosome conformation capture und next-generation sequencing zur Detektion episomaler HBV DNA in aktiv transkribierten Chromatinregionen

Einleitung:

In HBV-infizierten Hepatozyten liegt die HBV DNA als ‚covalently closed circular DNA‘ (cccDNA) episomal im Zellkern vor. Genomische HBV-Integrationen stellen einen potentiellen Pathomechanismus für hepatozelluläre Karzinogenese dar, was wahrscheinlich von epigenetischen Veränderungen durch den Transaktivator HBV X protein (HBx) maßgeblich beeinflusst wird. Bislang ist jedoch noch unklar, welche konkrete Rolle dabei die raumzeitliche Zellkernlokalisation von episomaler cccDNA und HBx sowie deren potentielle Interaktionen mit dem Wirtsgenom spielen.

Ziele:

Ziel dieser Arbeit ist es zu untersuchen, ob HBx und die episomale cccDNA mit spezifischen chromosomalen Loci assoziiert vorliegen und ob epigenetische Modifikationen und die nukleäre cccDNA und HBx Lokalisation Einfluss auf genomische Integrationsereignisse hat.

Methodik:

Wir haben circularized chromosome conformation capture (4C) Technologie gefolgt von next generation sequencing genutzt, um raumzeitliche Interaktionen von HBV cccDNA und genomischer Wirts-DNA in infizierten HepaRG Zellen zu analysieren. Die Verifikation auf Proteinebene erfolgte mittels RFP-trap magnetic bead Immunpräzipitation und Massenspektrometrie. Darüberhinaus haben wir die komplette HBx Sequenz und verschiedene subklonierte trunkierte HBx-Konstrukte in humane und murine Hepatozyten transfiziert und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) für spezifische posttranslationale Histonmodifikationen (PTM) durgeführt. Konsekutiv erfolgten Transkriptionsanalysen mit speziellem Fokus auf für die HCC-Entstehung relevante Gene.

Ergebnis:

4c Analysen zeigten hochspezifische intranukleäre Lokalisationsmuster von cccDNA und HBx, die deutlich mit aktivierenden Chromatinmarkern und stark transkribierten Genloci assoziiert waren. Bemerkenswerterweise zeigten repressive Chromatin-assoziierte PTMs im Gegensatz dazu grundverschiedene Lokalisationsmuster. Die Transfektionen der HBx-Deletionskonstrukte zeigten differenzielle Genexpression bei HCC-relevanten Genen.

Schlussfolgerung:

Basierend auf diesen Ergebnissen postulieren wir ein neuartiges Konzept für Virus-Wirt-Interaktionen, nach dem – anders als zuvor gedacht – HBV genomische Sequenzen im Zellkern von infizierten Hepatozyten mit funktionell aktiven Chromatinregionen assoziiert vorliegen.