Funktionelle und molekulare Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen im genetisch induzierten Mausmodell des kolorektalen Karzinoms

Einleitung:

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind das biologische Korrelat der Metastasierung, ihr negativer Einfluss auf die Prognose ist inzwischen gut etabliert. Aufgrund ihrer extremen Seltenheit und Variabilität der Oberflächenmarker sind CTCs im CRC jedoch schwer zu charakterisieren, daher ist die Metastasierungskaskade im CRC noch kaum verstanden. So legt die Diskrepanz zwischen der Anzahl von CTCs und die um Größenordnungen geringere Anzahl von Metastasen den Schluss nahe, dass nicht alle CTCs in der Lage sind, Metastasen zu bilden.

Ziele:

Aus o.g. Erwägungen heraus war das Ziel dieses Projekts die Etablierung eines Oberflächenmarker-unabhängigen, genetisch induzierten Mausmodells von CTCs im CRC sowie nachfolgend die funktionelle und molekulare Charakterisierung der CTCs.

Methodik:

Durch eine segmentale Infektion des Kolons mit einem Adeno-cre-Virus wurde in Mäusen mit konditionellen, onkogenen Mutationen in Apc, Kras, Tp53 und Cdh1 Kolonkarzinome induziert und mittels Koloskopie kontrolliert. Zusätzlich wurde ein Cre-Reporterallel (ZSGreen) in die Tiere eingekreuzt. Die CTCs wurden aus dem Blut der Tiere mithilfe des DEPArray NxT-Geräts berührungsfrei und als Einzellen isoliert und mittels RNAseq, qPCR und Immunofluoreszenz charakterisiert. Ihre Tumorgenität wurde in der Zellkultur und in vivo untersucht.

Ergebnis:

Wir etablierten ein genetisch induziertes Mausmodell des CRC, das reproduzierbar CTCs generiert. Durch das Reporterallel sind alle Tumorzellen grün fluoreszent und daher markerunabhängig im Blut detektierbar. Das DEPArray NxT erlaubt die Quantifikation und Isolation vitaler Einzelzellen. Abhängig vom Analysezeitpunkt konnten 60 – 80% der Tiere CTCs isoliert werden. Es konnten unter den GFP-positiven CTCs sowohl EpCAM-positive als auch EpCAM-negative Zellen isoliert werden, deren Expressionsprofil sich deutlich unterscheidet. Die CTCs sind in vitro kultivierbar und tumorigen in vivo.

Schlussfolgerung:

Wir haben ein Mausmodell etabliert, das reproduzierbar CTCs entwickelt. Diese können Marker-unabhängig isoliert werden und sind tumorigen. Dieses Modell erlaubt erstmals eine umfassende Charakterisierung von CTCs im CRC, um mögliche Therapieansätze für diese prognoseentscheidende Zellpopulation entwickeln zu können.