IGFBP2 – ein neues Zielgen der p53-Familie beim hepatozellulären Karzinom

Hintergrund:

Die Transkriptionsfaktoren der p53-Familie (p53, p63, p73) reagieren auf zelluläre Stresssignale durch Regulation eines definierten Genprogramms, so dass Fehler im Duplikationsprozess gestresster Zellen und damit die Entstehung von Tumoren verhindert werden. In einer Vielzahl von Tumoren, unter anderem dem hepatozellulären Karzinom (HCC), haben die Mitglieder der p53-Familie kanzerogene oder tumorsuppressive Eigenschaften. Abhängig von der jeweiligen p53 Splicevariante – mit Transaktivierungsdomäne (TA) oder dominant negativ (DN) – und den Eigenschaften der jeweiligen Bindungsstellen (BS) werden spezifische Zielgene aktiviert oder unterdrückt. In Vorarbeiten identifizierten wir IGFBP2 (Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 2) als potentielles Zielgen der p53-Familie mit prognostischer Relevanz beim HCC. Ziel dieser Arbeit war nun darzustellen, in welcher Weise die Regulation von IGFBP2 durch p53-Proteine erfolgt.

Methoden:

Hep3B Zellen wurden mit rAd-p53 und -TAp73 transfiziert. Die transkriptionelle Regulation von IGFBP2 wurde mittels qPCR bestimmt. Intra- und extrazelluläre IGFBP2-Proteinmengen wurden mit Western Blots und ELISA ermittelt. Eine Transfac Datenbankanalyse diente zur Identifizierung potentieller p53 und p73 BS im IGFBP2-Gen. Diese Sequenzen wurden kloniert, mutiert und in Luciferase-Reporterassays auf die Bindung von p53-Proteinen untersucht. Die Bindung von p53 und TAp73 an die jeweiligen BS wurde mittels CHIP-Analysen bestätigt.

Ergebnisse:

DieTransfektion von Hep3B-Zellen mit TAp73 führte zu einer über 25-fach erhöhten IGFBP2-Expression und zu deutlich erhöhten intra- und extrazellulären IGFBP2-Proteinmengen, während in den Kontrollen kein IGFBP2-Protein nachweisbar war. Nach Transfektion mit p53 war die IGFBP2-Expression um bis zu 7-fach erhöht. Zwei potentielle p53 und p73 BS liegen in der Promotorregion, 5 weitere potentielle p73-BS und eine p53-BS wurden im Intron 1 des IGFBP2-Gens identifiziert. Die Intron 1-abhängige Luciferaseaktivität war in TAp73-transfizierten Zellen um bis zu 150-fach, in TAp53-transfizierten Zellen um bis zu 20-fach erhöht. Mutation und Deletion der identifizierten p53-BS in Intron 1 resultierten in einer bis zu 90%igen Reduktion der Luciferaseaktivität in p53- und TAp73-transfizierten Zellen. Die Deletion einer der potentiellen p73-BS hatte eine um 85% verringerte Luciferaseaktivität in TAp73-transfizierten Zellen zur Folge. Anhand von CHIP-Analysen wurde die Bindung von p53 und TAp73 an die jeweiligen BS verifiziert.

Schlussfolgerung:

Diese Ergebnisse identifizieren IGFBP2 eindeutig als neues Zielgen für TAp73 und p53 beim HCC. Mit dem Nachweis der Wechselwirkung von TAp73 und IGFBP2 zeigen wir eine wichtige, bisher unbekannte Verbindung zwischen dem Netzwerk der p53-Familie und der IGF-Achse. Während p53-Proteine überwiegend tumor-inhibierende Effekte auf die Zelle haben, ist die IGF-Achse für proliferative Prozesse von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis dieser beiden wichtigen Signalwege scheint daher Tumoreigenschaften genau wie Therapieansprechen maßgeblich zu beeinflussen. Unsere Ergebnisse erweitern somit nicht nur das Verständnis für kanzerogene Prozesse beim HCC, sondern indizieren auch, dass sich durch Feinabstimmung dieser Signalwege neue therapeutische Möglichkeiten beim HCC bieten.