Multiplex Real-Time PCR zur Phänotypisierung heterogener Subpopulationen zirkulierender Tumorzellen beim metastasierten Mammakarzinom

Hintergrund:

Der Nachweis zirkulierender Tumorzellen (CTCs) ist ein unabhängiger Prognosefaktor für das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben bei Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom. CTCs stellen jedoch eine sehr heterogene Zellpopulation dar, weshalb ihre Detektion und molekulare Charakterisierung von großer Bedeutung ist um aktuell eingesetzte Therapieschemata zu optimieren und Therapieresistenzen zu vermeiden.

Ziel dieses Projektes ist es, einzelne CTCs mittels Genexpressionsprofil-Analyse zu charakterisieren.

Methoden:

Oligonukleotidpaare zum Nachweis von 30 Transkripten, die mit epithelialen oder mesenchymalen Zelleigenschaften oder einer Therapieresistenz assoziiert sind, wurden zusammengestellt und sowohl in unterschiedlichen Zellpools als auch auf Einzelzellebene mithilfe der Brustkrebszelllinien MDA-MB 231 (mesenchymal) und MCF-7 (epithelial) getestet. Zudem wurde anhand gespikter Brustkrebszellen der Einfluss von Zellfixierung (CellSave®) und Permeabilisierung (Triton X-100) auf die PCR-Qualität untersucht. Einzelzellen wurden mithilfe des CellCelector™-Mikromanipulators isoliert und die RNA extrahiert. Nach cDNA-Synthese und Präamplifikation wurden die Genexpressions-Profile im Multiplex Real-Time PCR-Ansatz erstellt und ausgewertet.

Ergebnisse:

Für alle 30 Transkripte können spezifische Amplikons erzeugt werden. In Titrationsexperimenten lassen sich die PCR-Reaktionen der „house keeping“ Gene GAPDH, UBB und ACTB bis auf 1 Zelle nachweisen. Die Signalstärken korrelieren linear mit zunehmender Zellzahl. Die Vorbehandlung der Zellen mit CellSave®, einer alleinigen Permeabilisierung oder beidem beeinträchtigt die PCR-Ergebnisse im Vergleich zu nativen Zellen nicht signifikant. Die Genexpressionsprofile einzelner nativer MDA-MB 231 und MCF-7 Zellen unterscheiden sich signifikant hinsichtlich epithelialer und mesenchymaler Transkripte.

Schlussfolgerung:

Gentranskripte lassen sich in zuvor fixierten und permeabilisierten Einzelzellen nachweisen. Die etablierte Multiplex-RT-PCR wird derzeit zur Charakterisierung einzelner CTC Subpopulationen eingesetzt.