Kryokonservierung von Rattenhepatozyten mit einer neuen Einfrier- und Rekultivierungslösung

Hepatozyten sind relativ empfindlich gegenüber Kryokonservierungsschädigung, insbesondere im 3D-Modell adhärenter Kulturen. Die Zellqualität nach Kryokonservierung wird, wie wir kürzlich zeigen konnten, neben physikalischen Parametern und dem Kryoprotektivum, auch von der Zusammensetzung der Einfrierlösung beeinflusst. Daher haben wir die Einfrierlösung für Hepatozyten optimiert und eine Rekultivierungslösung entwickelt.

Adhärente primäre Rattenhepatozyten oder Hepatozytensuspensionen wurden in Zellkulturmedium oder Varianten einer neuen serumfreien Einfrierlösung, jeweils mit 10% DMSO, eingefroren. Der Anteil vitaler adhärenter Zellen wurde direkt nach dem Auftauen und nach Rekultur, die metabolische Aktivität (Resazurinreduktion) nach Rekultur bestimmt.

Nach Kryokonservierung adhärenter Rattenhepatozyten in Zellkulturmedium verblieben 45 ± 9%, nach anschließender Rekultur (4h) in Zellkulturmedium 8 ± 3% vitale Zellen im Vergleich zu nicht eingefrorenen Kontrollkulturen. Die metabolische Aktivität betrug 15 ± 8%. Das Einfrieren in der optimierten Lösung mit makromolekularem Zusatz verbesserte die Vitalität direkt nach dem Auftauen erheblich (> 95% vitale Zellen), allerdings kam es immer noch zu massivem Zelltod in der Rekultur. Durch Einsatz der neuen Einfrierlösung und einer angepassten Rekultivierungslösung konnte der Anteil lebender Zellen nach 4h Rekultur auf 55 ± 2% und die metabolische Aktivität auf 74 ± 10% signifikant verbessert werden. Nach Einfrieren in Suspension konnte der Anteil vitaler, angehefteter Zellen nach Aussäen und 24h Kultur von 15 ± 8% (Zellkulturmedium) auf 56 ± 17% (neue Lösung) erhöht werden. Der protektive Effekt in Zellsuspensionen blieb auch bei Verwendung von 5 und 10% Glycerin statt 10% DMSO erhalten.

Zusammenfassend kann die Vitalität und die metabolische Aktivität von Rattenhepatozyten durch Einsatz optimierter Einfrier- und Rekultivierungslösung signifikant verbessert werden.