Analytische Validierung des NextGen Sequencing basierten TruRiskTM-Genpanels zur umfassenden Mutations- sowie CNV-Detektion in der Keimbahn

Zielsetzung: Moderne Hochdurchsatz-Sequenzierverfahren (Next Generation Sequencing) ermöglichen eine schnelle und kostengünstige Analyse von bis zu mehreren Millionen DNA-Fragmenten pro Lauf. Sogenannte Benchtop-Sequenzierer mit reduzierter Kapazität sowie verkürzten Laufzeiten ermöglichen einen Einsatz auch in Laboren mit mittlerem Probenaufkommen. Als Mitglied des Deutschen Konsortiums für Hereditären Brust- und Eierstockkrebs haben wir das konsortiumseigene 34-Gen-Panel (TruRiskTM) zur Detektion von Keimbahnmutationen technisch validiert.

Materialien: Die Validierung wurde mit 96 in den Panelgenen partiell vorcharakterisierten Proben durchgeführt.

Methoden: Sequenzierlibraries wurden mittels einer Transposase-basierten Anreicherungsmethode (SureSelectQXT, Agilent) generiert, auf dem MiSeq (Illumina) per paired-end Sequenzierung (v2; 2 × 250 bps) analysiert und durch einen kommerziellen Anbieter (Sophia Genetics, Genf) bioinformatisch hinsichtlich Einzelnukleotid-Varianten (SNVs), kurzer Insertionen/Deletionen (InDels) sowie struktureller Varianten (copy number variations, CNVs) ausgewertet.

Ergebnisse: Das Probenset wurde in sechs Sequenzierläufen analysiert. Die mittlere Read-Ausbeute pro Lauf betrug 32 Millionen Reads, wovon durchschnittlich 40% auf die genomische Zielregion entfielen. Die mittlere Sequenziertiefe entsprach 440 x, hierbei konnten 99,9% der Zielregion mit mindestens 50 x abgedeckt werden. Alle 615 bekannten kleineren Veränderungen wurden identifiziert, darunter 571 SNVs sowie 44 InDels. Zusätzlich wurden 6208 zusätzliche Varianten nachgewiesen, welche manuell verifiziert und/oder in Datenbanken gelistet waren und somit als real bewertet wurden (Sensitivität/Spezifität 100%). Zudem wurden 27 der 28 CNVs (96%) bioinformatisch korrekt erkannt. Eine Probe (1%) konnte nicht auf CNVs analysiert werden. Intra- und Inter-Run-Replikate zeigten eine Wiederhol- bzw. Reproduzierbarkeit von je 100%. Nach Workflow-Implementierung sind aktuell rund 200 Patienten analysiert.

Zusammenfassung: Der dargestellte Workflow ermöglicht eine robuste und akkurate Detektion von Keimbahnmutationen in den Genen des TruRiskTM-Panels.