Z Gastroenterol 2016; 54 - KV374
DOI: 10.1055/s-0036-1587149

Charakterisierung negativer Regulatoren des Wnt Signalweges mittels eines CRISPR/Cas9 basierten kombinatorischen Screens in murinen intestinalen Organoiden

N Rindtorff 1, J Sauer 2, T Zhan 1, I Augustin 1, H Farin 3, B Fischer 2, M Boutros 1
  • 1DKFZ Heidelberg, Signalwege und Funktionelle Genomik, Heidelberg, Deutschland
  • 2DKFZ Heidelberg, Computational Genome Biology, Heidelberg, Deutschland
  • 3Georg Speyer Haus, Frankfurt, Deutschland

Einleitung: Etwa 90% der kolorektalen Karzinome (KRK) zeigen eine Überaktivierung des Wnt Signalweges. Bei 80% der KRK ist eine Mutation des Wnt-Supressors APC ursächlich, die früh während der Karzinogenese auftritt. Neben APC sind weitere häufig mutierte negative Regulatoren des Wnt Signalweges bekannt. Jedoch ist unklar, ob eine Mutation dieser Gene ausreicht, um den Wnt Signalweg derartig zu aktivieren, dass eine Initiation einer Karzinogenese möglich ist. Aus murinen Dünn- und Dickdarm isolierte intestinale Organoide sind ein adäquates Model für die Untersuchung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse des Darmepithels. In Kombination mit der CRISPR/Cas9 Technologie zur Genomeditierung erlauben intestinale Organoide die in vitro Modellierung der Krebsentwicklung.

Ziele: Aufklärung der Rolle einzelner Suppressor-Gene des Wnt Signalweges in der Entstehung des kolorektalen Karzinoms.

Methoden: Intestinale Organoide werden aus Villin-Cre-Cas9-GFP Mäusen isoliert und kultiviert. Die genetische Manipulation der Organoide erfolgt über lentivirale Infektion von single guide RNAs. Genetisch veränderte Organoide werden auf ihre Unabhängigkeit des Wachstums von externen Wnt-Liganden getestet.

Ergebnis: Der Einzel-Knockout von APC sowie der kombinatorische Knockout der Ubiquitin Ligasen RNF43/ZNRF3 führen zu R-Spondin unabhängigem Wachstum von intestinalen Organoiden. Mittels bioinformatischer Analyse wurden ca. 30 Kandidatengene mit häufiger Mutationsfrequenz und Implikation im Wnt Signalweg definiert. Ein lentiviraler kombinatorischer Arrayed Screen wurde etabliert und der Einfluss des Knockouts der Kandidatengene auf das R-Spondin unabhängige Zellwachstum untersucht.

Schlussfolgerung: Der systematische Knockout von Genen in intestinalen Organoiden durch CRISPR/Cas9 Technologie ist eine effiziente Methode, um Genfunktionen systematisch und im hohen Durchsatz in einem physiologischen Modell des Darms zu untersuchen.