Visualisierung der makromolekularen Passage durch intestinale Epithelien

Einleitung: Epithelien stellen eine Barriere zwischen „internen“ und „externen“ Kompartimenten des Körpers dar. Die Dysregulation dieser Barriere ist eine der Voraussetzungen zur Entwicklung einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung. Bislang kann jedoch die epitheliale Passage von Makromolekülen (MM) nur mit globalen Messungen, wie z.B. Tracerflux-Experimenten, analysiert werden. Diese mitteln nur über die Beiträge einzelner Zellen und können lokale Barrieredefekte nicht auflösen.

Ziel: Etablierung einer neuen Methode zur Lokalisierung der makromolekularen Passage durch intestinale Epithelien.

Methodik: Caco2-BBe-, HT-29/B6-, MDCKII-Epithelzellen und Ratten-Colonmucosae wurden mittels des neuen Sandwich-Assay untersucht. Dazu werden die Zellen mit biotinylierten und fluoreszenten Tracern verschiedener Größe und Biologie exponiert. Basolateral lokalisiertes Avidin „fängt“ MM, die parazellulär Epithelien passieren. Die nachfolgende konfokale Mikroskopie (LSM) dokumentiert lokale MM-Durchtritte.

Ergebnisse: Tracer (Dextrane und Albumin) verschiedener Größe wurden apikal dem Epithelzelllayer zugegeben. Ausschließlich die Tracer, die die Epithelbarriere passierten, wurden durch die als „Scavenger“ funktionierenden basolateralen Avidinmoleküle gebunden und verursachten fluoreszente Signale, die daher exklusiv epithelialen MM-Durchtritten entsprachen. Mittels nachfolgender Mikroskopie war dann eine Darstellungsgenauigkeit der makromolekularen Permeabilität im sub-µm-Bereich möglich. Die basale MM-Passage war in allen Zelllinien sehr gering und entsprach parallel durchgeführten globalen Fluxmessungen. MM-Durchtritte unbehandelter Zellen waren in ihrer Verteilung inhomogene, parazelluläre Ereignisse und mit steigender Zellkulturdauer reduziert. Nach Vorbehandlung der Epithelien mit EGTA oder pro-inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IFN-γ) stieg die Zahl der Durchtrittsereignisse massiv an. In Colonmucosae war der makromolekulare Durchtritt spezifisch am Oberflächenepithel zu verorten.

Schlussfolgerung: Der Sandwich-Assay stellt ein erstes, sehr unkompliziert durchführbares Verfahren zur lokalen Auflösung makromolekularer Durchtritte dar und erweitert daher die Möglichkeiten, die intestinale Barriere zu untersuchen.