Intrazellulärer oxidativer Stress und Peroxisomen: Mechanismen der H2O2-Freisetzung aus intakten Leberperoxisomen

Peroxisomen sind essentielle Organellen mit einer besonders hohen Konzentration in der Leber. Sie spielen eine entscheidende Rolle im Stoffwechsel von Fetten und reaktiven Sauerstoffspezies. Charakteristisch ist die Bildung von H₂O₂ über peroxisomale Oxidasen. Peroxisomaler oxidativer Stress wird als wichtiger Pathomechanismus für eine Reihe epidemiologisch relevanter Lebererkrankungen, besonders der nicht-alkoholischen Fettleberhepatitis (NASH), diskutiert. Bisher fehlten geeignete Methoden, den peroxisomalen H₂O₂ -Stoffwechsel an intakten Peroxisomen direkt zu untersuchen.

Auf der Basis einer luminometrischen Reaktion haben wir eine Methode etabliert, die die gleichzeitige Bestimmung von H₂O₂ -Bildung und -Verbrauch an intakten Peroxisomen in Echtzeit ermöglicht. Mit einer optimierten Peroxisomenpräparation unter Entfernung extrahierter Enzyme wird demonstriert, dass vor allem aktivierte Fettsäuren von C6– C24 zu einer direkten Freisetzung von H₂O₂ ins Zytosol führen. Die morphologische und biochemische Integrität der aus Wistar-Ratten isolierten Peroxisomen wurde elektronenmikroskopisch und durch das peroxisomale Proteinmuster überprüft.

Überraschenderweise ist die H₂O₂-Freisetzung der intakten Peroxisomen höher als die der lysierten Organellen. Peroxisomen setzen offensichtlich trotz des hohen Gehalt an H₂O₂-degradierender Katalase obligat H₂O₂ frei. Das Ausmaß dieser H₂O₂-Freisetzung wird dabei nicht durch die Peroxisomenmembran, sondern durch die intraperoxisomale Lokalisation der Oxidase definiert. Mittels der Fluoresenzsonde DCHF gelingt der in vitro-Nachweis von zytosolischem H₂O₂ in HepG2-Zellen in Gegenwart unterschiedlicher peroxisomaler Substrate. An Fibrat-behandelten Wistar-Ratten als experimentellem Modell einer Peroxisomenproliferation demonstrieren wir schließlich, dass die Peroxisomen behandelter Tiere eine 2,5-fach höhere H₂O₂-steady-state-Konzentation in Gegenwart von aktivierten Fettsäuren aufweisen.

Unsere Beobachtungen demonstrieren, dass Leberperoxisomen obligat H₂O₂ in die Umgebung freisetzen. Unter den Bedingungen einer pathologischen Peroxisomenproliferation wird dieser peroxisomale oxidative Stress weiter potenziert. Das neu entwickelte Verfahren ermöglicht erstmals direkte funktionelle Messungen an intakten Peroxisomen.