Geburtshilfe Frauenheilkd 2014; 74 - A50
DOI: 10.1055/s-0034-1376510

nCounterTM-Analysis-System als Alternative zur qPCR für das molekulare Subtyping beim Mammakarzinom (Pilotprojekt)

K Stückrath 1, E Kantelhardt 1, C Thomssen 1, M Vetter 1
  • 1Klinik und Poliklinik für Gynäkologie Universitätsklinikum Halle (Saale)

Fragestellung:

Bei der Diagnose eines primären Mammakarzinoms gilt die Immunhistochemie (IHC) als die Standardmethode zur Einteilung in die IHC-Untergruppe und der entsprechenden Therapieempfehlung. Ergänzend dazu werden seit einigen Jahren Genexpressionsanalysen zur Bestimmung der molekularen Subgruppen von internationalen und nationalen Leitlinien empfohlen. Mit dem nCounterTM-Analysis-System steht eine Methode zur direkten RNA-Quantifizierung zur Verfügung. Die gemessene Genaktivität soll mit der quantitativen PCR (qPCR) und der Proteinexpression (IHC) in einem Pilotprojekt verglichen werden.

Methodik:

Im Rahmen der prospektiven PiA-Studie (Prognose im Alltag; pTx pNx pM0 Gx HRx HER2x; 2009 – 11) wurde Tumorgewebe und klinische, pathologische Daten von 1142 primären Mammakarzinom-Patientinnen zusammengetragen.

RNA wurde sowohl aus nativem (n = 6) als auch aus FFPE- Gewebe (n = 2) isoliert, wobei die FFPE-RNA mit je zwei säulenbasierten Methoden unterschiedlicher Hersteller (Qiagen, Roche) extrahiert wurde. Die Qualität der RNA wurde mittels RIN-Wert überprüft.

Die Genaktivität wurde mit folgenden Methoden bestimmt:

  • nCounterTM-System: zwei genspezifische Sonden hybridisieren direkt an die RNA, die capture probe (biotinyliert) und die reporter probe (mit Fluorophor-Barcode). Die Fluoreszenzsignale (Counts) werden detektiert und digitalisiert. Expressionsbestimmung von 73 Genen pro Probe

  • qPCR nach vorangegangener cDNA-Synthese an 3 Genen

  • IHC-Bestimmung: ER, PgR, HER2.

Ergebnisse:

Die durch nCounter™-System und qPCR ermittelten RNA-Expressionen korrelieren linear (R2= 0,92). Es ist der Trend erkennbar, dass eine hohe RNA-Expression mit einem hohen IHC-Score korreliert. Diese Daten müssen in Folgeexperimenten mit höheren Fallzahlen validiert werden. FFPE-RNA konnte trotz deutlicher quantitativer und qualitativer Unterschiede zur Frischgewebs-RNA mit dem nCounterTM-System quantifiziert werden, bei der qPCR war dies nicht bei allen Genen zweifelsfrei möglich. Im Vergleich der FFPE-RNA-Extraktion-Methoden erzielte die von Qiagen sowohl höhere RNA-Ausbeute, als auch bessere Qualität. Die nCounterTM-Expressionsdaten beider Präparationsmethoden stimmten überein.

Schlussfolgerung:

Das nCounterTM-System ist eine Alternative zur qPCR. Ein Vorteil ist die direkte Verwendung von RNA bei der Quantifizierung ohne vorrangegangener cDNA-Synthese und die große Anzahl an Genen (bis zu 800), die gleichzeitig pro Probe detektiert werden können. In Zukunft könnte das molekulare Subtyping mittels nCounterTM-System inklusive eines biostatistischen Tools erfolgen.