Optimierung der Rattenleber-Dezellularisierung durch arterielle Perfusion unter oszillierenden Umgebungsdruckschwankungen

Im Rahmen des sog. tissue engineering wird durch De- und Rezellularisierung von Gewebe oder ganzen Organen versucht, funktionelle Organoide in vitro zu generieren, um langfristig den bestehenden "Organmangel" zu überwinden.

Es wurden bereits Protokolle für die Dezellularisierung von Mäuse-, Ratten-, Frettchen-, Schafs- und Schweinelebern veröffentlicht. Diese Protokolle haben gemein, dass die Dezellularisierung durch Pefusion von alkalischen Detergentien über die Pfortader erreicht wird.

Wir berichten über eine neue Methode zur Rattenleberdezellularisierung durch Pefusion von Triton-X 100 und SDS über die Leberarterie unter oszillierenden Umgebungsdrücken. Diese Umgebungsdrücke werden durch eine proprietäre Perfusionsvorrichtung generiert und verbessern signifikant die Mikroperfusion und somit die Homogenität der Dezellularisierung. Die Homogenität der Dezellularisierung ist ein bisher vernachlässigter Faktor und wichtig um die Schäden der Extrazellulärmatrix durch den Dezellularisierungsprozess zu minimieren: Ist ein Oragn inhomogen perfundiert, so kann man eine komplette Dezellularisierung durch Verlängerung der Perfusionsdauer oder Erhöhung des Perfusionsdruckes erreichen. Somit wirken die Detergentien an gut perfundierten Arealen aber umso mehr und führen dort vermehrt zu Schäden.

Im Rahmen dieser Studie wurden vier Versuchsgruppen gebildet und miteinader verglichen: Perfusion über die Pfortader ohne oszillierende Druckschwankungen (PA-P; n = 6) und mit Druckschwankungen (f: 12/min; Pmax 35mbar, Pmin 0mbar) (PA+P; n = 6), sowie entsprechende Perfusion über die Leberarterie (HA-P; n = 6), (HA+P; n = 6). Das genutzte Perfusionsprotokoll (Laufrate 5 ml/min; 90 Minuten 1% Triton X-100; 90 Minuten 1% SDS) war in allen Versuchsgruppen identisch. Nach erfolgter Perfusion wurden die dezellularisierten Lebermatrizen (DLM) histologisch, sowie immunhistochemisch aufgearbeitet und biochemisch analysiert (DNA Gehalt, Gehalt an Glykosaminoglykanen, Gehalt an "hepatocyte growth factor"). Außerdem wurden Ausgusspräparate sowie eine dreidimensionale (3D) Computertomografie (CT) durchgeführt, um die Intaktheit der Mikrostrukturen zu überprüfen.

Die Perfusion über die Leberarterie zeigte deutlich homogenere Dezellularisierungsergebnisse, als die portalvenöse Perfusion. Ferner führte die Anwendung von Umgebugsdruckschwankungen zu einer signifikanten Verringerung des DNA-Gehaltes in den DLM. Im Bezug auf den Gehalt an Glykosaminglykanendeadmousewurden keine signifikanten Differenzen zwischen den Versuchsgruppen deutlich. Die Ausgusspräparate, sowie das 3D-CT zeigten intakte vaskuläre Strukturen nach erfolgter Dezellularisierung.

Die präsentierte Methode zur Rattenleberdezellularisierung ist einfach reproduzierbar, schnell (3h) und schont die Extrazellulärmatrix und stellt somit eine deutliche Optimierung der bisher verwendeten Verfahren dar.