Die potentielle E3-Ubiquitin-Ligase KCMF1 reguliert differentiell die FOXO Transkriptionsfaktoren

Einleitung: KCMF1 ist ein phylogenetisch hoch konserviertes Protein mit einer funktionellen Ringfingerdomäne, die für E3-Ubiquitin-Ligasen typisch ist. KCMF1 fördert in vitro und in vivo Proliferation, Migration und Invasion. Im Mausmodell der acinär-duktalen Metaplasie des Pankreas wird diese Metaplasie in Abwesenheit von KCMF1 gehemmt. Molekular interagiert KCMF1 mit FOXO Transkriptionsfaktoren.

Ziele: Die funktionelle Interaktion mit FOXO Transkriptionsfaktoren und die Verbindung zur potentiellen Aktivität als E3-Ubiquitin-Ligase wurden im Weiteren analysiert.

Methodik: Die molekulare Funktion und Interaktion wurde durch Luziferaseassays, Co-Immunopräzipitation (Co-IP), GST-Pulldown, Ubiquitinylierungsassays, Ubiquitinligaseassays und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) unter Verwendung spezifischer KMCF1 und FOXO1 Mutanten untersucht. Im Weiteren wurden KCMF1 defiziente Tiere phänotypisiert.

Ergebnis: KCMF1 verfügt C-terminal über eine funktionelle Ringfingerdomäne. Diese wurde unter Einsatz verschiedener Mutanten als Ubiqitin-bindene Domäne charakterisiert. Die enzymatische Aktivität als E3-Ubiquitin-Ligase wurde in vitro analysiert. KCMF1 interagiert mit FOXO Transkriptionsfaktoren über die N-terminale Prolin-reiche-Domäne und inhibiert differentiell die transkriptionelle Aktivität von FOXO1 an FHRE und IRS Bindungsstellen. DNA-Pulldown und ChIP-Assays legen eine direkte Interaktion der Proteine an der DNA nahe. Diese Interaktion und funktionelle Inhibition wird durch oxidativen Stress verstärkt und bevorzugt pseudoacetylierte FOXO1 Mutanten. Die KCMF1 vermittelte Hemmung der FOXO1 abhängigen Repression resultiert in einer Induktion von klassischen FOXO Zielgenen wie IGFBP1 in vitro und in vivo. Ein Überexpression von KCMF1 resultiert in einer verstärkten Ubiquitinierung von FOXO1 unter oxidativem Stress.

Schlussfolgerung: KCMF1 wirkt als direkter transkriptioneller Repressor des FOXO1 Signalwegs in vitro und in vivo. Die Frage, ob diese Regulation direkt abhängig von der E3-Ubiquitin-Ligaseaktivität von KCMF1 ist, ist Gegenstand aktueller Untersuchungen.