Differenzierung humaner ES-Zellen in definitives Entoderm durch Inhibition der GSK3 beta und Aktivierung des Nodal-Signalwegs

Fragestellung: Die Differenzierung von ES-Zellen in pankreatische Zellen erfordert in vitro die Generierung des definitiven Entoderms. Durch die Aktivierung des Nodal-Signalwegs lassen sich ES-Zellen in dieses Keimblatt differenzieren. Während der Gastrulation, noch vor der Entstehung der triblastischen Keimscheibe, lässt sich allerdings im Primitivstreifen eine hohe Aktivität des Wnt-Signalwegs nachweisen. Daher könnte die sequentielle Aktivierung des Wnt-Signalwegs und des Nodal-Signalwegs ES-Zellen mit höherer Effizienz in entodermale Zellen differenzieren als über Nodal alleine.

Methodik: Humane ES-Zellen wurden mittels verschiedener Kombinationen aus Wnt3a/Activin A, CHIR-99021/Activin A oder Activin A alleine für drei Tage differenziert. CHIR-99021 ist ein potenter GSK3ß Inhibitor und damit gleichzeitig Aktivator des kanonischen Wnt-Signalwegs. Zur Analyse wurden die Zellen mittels qRT-PCR auf die Expression der Markergene T, MIXL1, SOX17, FOXA2 und GSC untersucht. Außerdem wurden FACS-Analysen der entodermalen Oberflächenmarker CXCR4 und CD49e durchgeführt, sowie Immunfärbungen für SOX17 und FOXA2 erstellt.

Ergebnisse: Die FACS-Analyse zeigte, dass die Kombination von CHIR-99021/Activin A ca. 60% und die Behandlung mit Wnt3a/Activin A ca. 22% CXCR4/CD49e doppelpositive Zellen hervorbrachte. Die Behandlung mit Activin A alleine zeigte nur 2,2% positive Zellen. In der Genexpressionsanalyse wurde die Expression von Markern des Primitivstreifens (T, MIXL1), sowie von Markern des Entoderm (SOX17, FOXA2, GSC) untersucht. Die sequentielle Behandlung mit CHIR-99021 und Activin A zeigte eine deutliche T und MIXL1-Expression nach 24h, die während der 48h Behandlung mit Activin A zurückging, während parallel die Expression der entodermalen Gene signifikant anstieg. Die Maxima der Expression war für alle Gene signifikant höher im Vergleich zur Wnt3a/Activin A bzw. Activin A Behandlung. Die Ergebnisse der FACS-Analyse und der qRT-PCR Analyse wurden immunhistochemisch bestätigt. Hier zeigte sich an fixierten Zellen eine annährend homogene Doppelfärbung für SOX17 und FOXA2 nach Induktion mit CHIR-99021/Activin A. Die Kombination mit Wnt3a/Activin A war wesentlich ineffizienter. Hier konnten nur ca. 20% doppelt-positive Zellen nachgewiesen werden.

Schlussfolgerungen: Diese Ergebnisse zeigen, dass eine effiziente entodermale Differenzierung von humanen ES-Zellen nur dann erfolgen kann, wenn diese über den Wnt-Signalweg zunächst in Zellen des Primitivstreifens überführt werden. Dieses Entwicklungsstadium ist durch eine hohe T-Expression gekennzeichnet und lässt sich durch Behandlung mit Activin A effizient und schnell in definitives Entoderm differenzieren. Der Nodal-Signalweg alleine, aktiviert durch Activin A, ist nur in geringem Maße fähig, diese Differenzierung zu induzieren. Daher ist festzustellen, dass die entodermale Differenzierung von humanen ES-Zellen primär Wnt-abhängig und sekundär Nodal-abhängig ist.