Identifizierung polybakterieller DNA im Aszites mittels Nachweis und Charakterisierung von 16S rRNA Gensequenzen

S Krohn; J Hartmann; A Brodzinski; A Chatzinotas; I Fetzer; S Böhm; T Berg

doi:10.1055/s-0032-1323958

Zeitschrift für Gastroenterologie, Inhaltsverzeichnis

Identifizierung polybakterieller DNA im Aszites mittels Nachweis und Charakterisierung von 16S rRNA Gensequenzen

S Krohn ¹^,², J Hartmann ¹, A Brodzinski ¹, A Chatzinotas ², I Fetzer ², S Böhm ¹, T Berg ¹

¹Universitätsklinikum Leipzig, Abteilung für Gastroenterologie und Rheumatologie, Sektion Hepatologie, Leipzig, Germany
²Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung – UFZ, Department für Umweltmikrobiologie, Leipzig, Germany

Abstract

Hintergrund: Die spontane bakterielle Peritonitis (SBP) ist eine schwerwiegende Komplikation bei Patienten mit Leberzirrhose, deren Prognose durch eine schnelle und gezielte Antibiotikatherapie positiv beeinflusst werden kann. Da der Nachweis einer bakteriellen Infektion mittels kulturabhängiger Methoden teilweise unzuverlässig ist, wird eine SBP auch ab einem Wert von 500 Leukozyten/µl Aszites und negativem Kulturbefund antibiotisch therapiert. In dieser Studie wurde die kultivierungsunabhängige 16S rRNA Genamplifikation für einen schnellen Nachweis von bakterieller DNA (baktDNA) im Aszites etabliert. Positive Aszitesproben wurden anschließend mittels Terminaler Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (T-RFLP) und direkter Sequenzierung charakterisiert.

Methoden: Es wurden 98 Aszitesproben von 43 Patienten untersucht. 16S rRNA Gene wurden mittels real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und anschließend zwei universellen Primern direkt sequenziert. Mischsequenzen wurden unmittelbar mit der web-basierten Software RipSeq (iSentio) analysiert. Die Komposition der bakteriellen DNA aller Aszitesproben wurde mittels T-RFLP Analyse untersucht.

Ergebnisse: In 57/98 (58%) der Aszitesproben wurde baktDNA nachgewiesen. Interessanterweise zeigten dabei 51/57 (89%) der Proben keine erhöhten Leukozytenwerte. Die verbliebenen Aszitesproben (41/98, 41%) waren frei von baktDNA. Mittels T-RFLP zeigte sich in 56/57 (98%) der baktDNA positiven Aszitesproben eine Vielzahl von „operational taxonomic units“ (OTU, Anzahl insgesamt: 39; Mittelwert pro Probe: 5,2). Mithilfe der direkten Sequenzierung der 16S rRNA Genamplifikate konnten 45 Gattungen von vorrangig gram positiven Bakterien identifiziert werden.

Schlussfolgerung: Mittels PCR-Amplifikation des 16S rRNA Gens und anschließender T-RFLP Analyse kann in einer Aszitesprobe hauptsächlich polybakterielle DNA nachgewiesen werden. Eine direkte Sequenzierung der PCR-Produkte sowie deren unmittelbare Auswertung mit der Software RipSeq bieten zudem die Möglichkeit die dominantesten Sequenztypen im Aszites zu charakterisieren. Dies könnte bei Patienten mit erhöhten Leukozytenwerten und negativem Kulturbefund zu einer Optimierung der Antibiotikatherapie dienen.