Retrograde Perfusion mit Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFDA-SE): eine neue Methode zur Visualisierung von Gallengängen und Lebergefäßen und zur Isolierung vitaler Cholangiozyten in der Maus

Hintergrund: Aktuelle Methoden für die histologische Darstellung der Gallenwege und Blutgefäße und für die Isolierung vitaler Cholangiozyten sind mit einer Vielzahl von technischen Schwierigkeiten begleitet, vor allem bei Mäusen. Ziel war es daher, ein alternatives und unkompliziertes Verfahren zur Isolation primärer Cholangiozyten und zur Visualisierung der Gallenwege und Blutgefäße in der Maus- und Rattenleber zu entwickeln.

Methoden: Bei zwanzig Wildtyp-Mäusen wurden die Gallengänge intravital perfundiert: nach Abtrennung der Leberränder und Kanülierung der Gallenblase mit einem 26G-Katheter wurden 5–7ml Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidylester Lösung (CFDA-SE) retrograd in die Gallenwege injiziert und die Leber mit Paraformaldehyd fixiert oder als Einzel-Zell-Suspension für die FACS-Analyse aufbereitet. Bei zehn Lewis Ratten wurde das Gefäßsystem mit ca. 100ml Heparinlösung und 10–15ml CFDA-SE Lösung über die Vena cava perfundiert. Die Effektivität der Perfusion bzw. Cholangiozyten-Isolierung wurde mittels Indian-Ink bzw. CK19-Immunhistochemie kontrolliert.

Ergebnisse: Histomorphologisch zeigte sich in Kryo-und Paraffinschnitten eine starke Fluoreszenz der Gallengänge und der vaskulären Strukturen bis in die Peripherie. Optimale Ergebnisse wurden mit 180µM CFDA-SE-Lösung erzielt. Vitale Cholangiozyten ließen sich aus der Leberzellsuspension über ihre CFDA-Fluoreszenz isolieren und kultivieren.

Schlussfolgerung: Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass sich mittels Perfusion mit CFDA-SE schnell und kostengünstig 1. Gallengänge (Abb.1A) und Blutgefäße (Abb.1C) in der Maus- und Rattengewebe detailliert visualisieren und 2. vitale primäre Cholangiozyten effektiv isolieren lassen (Abb.1B).

Abb.1