Z Gastroenterol 2011; 49 - P189
DOI: 10.1055/s-0031-1285461

Die Proteinkinase D2 reguliert SNARE-Komplexe und steuert die Sekretion von Chromogranin A in humanen neuroendokrinen Tumorzellen

U Maaß 1, C Ruhland 1, JL Eismann 1, C Münzberg 1, G Adler 1, T Seufferlein 2, G von Wichert 1
  • 1Universitätsklinikum Ulm, Innere Medizin I, Ulm, Germany
  • 2Universitätsklinikum Halle, Innere Medizin I, Halle (Saale), Germany

Einleitung: Chromogranin A wird in von neuroendokrinen Zellen sezerniert. Ein wichtiger regulatorischer Schritt ist die Vesikelfreisetzung aus dem Transgolginetzwerk. Hierbei erfolgt beim Verschmelzen eines Vesikels mit seiner Zielmembran die Ausbildung und spätere Wiederauflösung von heterotrimeren SNARE-Komplexen. Bekanntermaßen kontrolliert die Proteinkinase D2 die Abgabe exo- und endokriner Granula aus dem TGN. Inwieweit PKD2 in diesem Rahmen mit SNARE-Proteinen, dem Chaperon alpha-SNAP oder der ATPase NSF interagiert, ist Gegenstand unserer Untersuchungen.

Methodik: Biochemische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Interaktion der PKD2 mit a-SNAP, NSF, SNAP25 und Syntaxin sowie nähere Charakterisierung über GFP-markierte PKD2-Deletionsmutanten. Untersuchung der Komplexierung von SNAP25 und Syntaxin (t-SNAREs) in Abhängigkeit von der Aktivität der PKD2 (Koimmunopräzipitation, Pull-down-assay, FRET-basierte Fluoreszenzmikroskopie nach PKD2-siRNA-Knockdown oder Transfektion dominant negativer PKD2).

Ergebnis: Als Interaktionspartner der Proteinkinase D2 konnten sowohl biochemisch in Koimmunopräzipitationsexperimenten wie auch fluoreszenzmikroskopisch das SNARE-Protein SNAP25 sowie das Chaperon alpha-SNAP identifiziert werden. Durch Verwendung GFP-markierter PKD2-Deletionsmutanten charakterisierten wir die Kinasedomäne der PKD2 als essentiell für die Interaktion.

Auf funktioneller Ebene besteht nach Knockdown der PKD2 eine perinukleäre Chromogranin A-Retention. Weiterhin konnten wir in der Koimmunopräzipitation sowie in einem der FRET-basierten Fluoreszenzmikroskopie-Verfahren beobachten, dass SNARE-Proteine vermehrt in komplexierter Form vorliegen.

Schlussfolgerung: Die PKD2 ist über die Interaktion mit SNAP25 und alpha-SNAP an der Auflösung der SNARE-Komplexe und deren Recycling beteiligt und reguliert die Chromogranin A-Sekretion humaner neuroendokriner Tumorzellen.