Eine humane BRAF V600E-Genknockout-Zelllinie als präklinisches Modellsystem für individualisierte Therapieansätze im kolorektalen Karzinom

Einleitung: Bis zu 18% der Patienten mit kolorektalem Karzinom weisen eine tumorspezifische KRAS/BRAF-Signalwegaktivierung durch die onkogene V600E-Mutation in BRAF auf. Diese Aktivierung scheint das Ansprechen auf bestimmte Chemotherapeutika und insbesondere auf Targeted Therapies mit EGFR-, MAPK- oder Multikinase-Inhibitoren zu modulieren. Daher könnte V600E-mutiertes BRAF einen prädiktiven Marker für individualisierte Therapieansätze darstellen.

Ziele: Pharmakogenetische Charakterisierung der Bedeutung der BRAF-Mutation in der heterozygot BRAF-mutierten kolorektalen Zelllinie RKO (BRAF onc/onc/wt).

Methoden: Mittels seriellem Somatic Cell Gene Targeting wurden die beiden onkogenen, bzw. das Wildtyp-BRAF-Allel inaktiviert. Etablierung und Charakterisierung der Zellklone RBO-1 (RKO BRAF(onc/-/-), RBO-2 (RKO BRAF(onc/-/-) und RBW-1 (RKO BRAF(wt/-/-) in Zellvitalitäts- und Proliferationsassays.

Ergebnisse: In den Proliferationsassays zeigten sich keine für den BRAF-Genotyp spezifischen Sensitivitätsunterschiede gegenüber konventionellen Chemotherapeutika (5-FU, Etoposid, Paclitaxel, Mitomycin). Unerwartet ergaben sich ebenfalls keine signifikanten Proliferationsunterschiede nach Behandlung mit zielgerichteten Agenzien (EGFR- und Multikinase-Inhibitoren). Allerdings wiesen spezifisch die Onkogen-deletierten Zellklone unter Serumentzug im Vergleich mit Kontrollzellen initial eine deutlich verringerte Proliferation auf. Nach fortgesetztem Serumentzug gingen hingegen nur die Kontrollzellen, nicht aber Zellklone ohne V600E-Mutation in Apoptose über.

Diskussion: In dem von uns etablierten genetischen Modell konnten wir nach Serumentzug einen neuen BRAF-abhängigen Phänotyp identifizieren, der im Weiteren mechanistisch charakterisiert werden soll. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass entgegen dem linearen Verständnis des MAPK-Signalweges die Resistenz gegen EGFR-Inhibitoren in RKO-Zellen nicht allein durch die V600E-Mutation vermittelt wird. Schließlich stellt unser Modell ein ideales System zur Charakterisierung und Validierung spezifischer BRAF-Inhibitoren dar, das auch potentielle off-target Effekte dieser Substanzen berücksichtigt.