Quantifizierung von CTC's beim Mammakarzinom mithilfe der Taq-Man-PCR

Zielsetzung:

Der Nachweis zirkulierenden Tumorzellen (CTC) mittels Immunfluoreszenz ist ein kostenintensives und zeitaufwendiges Verfahren, das bisher noch keinen Einzug in die Routinediagnostik gehalten hat. Der Nachweis von CTC's aus dem peripherem Blut soll in dem laufenden Forschungsprojekt mithilfe der Real-Time-PCR (RT-PCR) erfolgen. Dafür ist es zunächst nötig, eine Eichkurve für tumorspezifisch exprimierte Gene zu erstellen, die die Genexpression, in Abhängigkeit von der Anzahl, der im Blut vorhandener Tumorzellen zeigt.

Materialien und Methoden:

Aus dem peripherem Blut gesunder Probanden wurden Leukozyten über Dichtegradientenzentrifugation gewonnen, angereichert und mit 0–100.000 MCF-7 bzw. Cama-1-Zellen/ml Blut versetzt. Aus dem Zellpellet wurde die RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und für in eine RT-PCR (Taq-Man) verwendet. Die Gene Cytokeratin (CK) 8, 18 und 19 dienten bei der Quantifizierung als tumorspezifische Gene, wobei 18S als Referenzgen verwendet wurde.

Ergebnis:

In beiden Zelllinien findet man für CK 18 ab 1000 Zellen/ml einen nahezu linearen Anstieg in der Relativen Quantifizierung (RQ). Für CK8 zeigt sich bei Cama-1 ein fast exponentieller Anstieg, bei MCF-7 stagniert die Kurve der RQ ab 10000 Zellen/ml in einem Plateau. Für CK 19 ist eine einheitliche Tendenz nicht zu beobachten.

Zusammenfassung:

Eine Quantifizierung von CTC's aus Blut ist mit den Genen CK 8 und CK 18 ab 1000 Zellen/ml möglich; bei Cama-1 Zellen ist eine Quantifizierung mithilfe von CK18 bereits zwischen 100 und 1000 Zellen möglich. CK 19 ist für die Quantifizierung von CTC's am wenigsten geeignet. Im Rahmen der geplanten zukünftigen Untersuchungen im peripherem Blut von metastasierten Mammakarzinom Patientinnen, wird sich die Praktikabilität und Effektiität der Methode zeigen.