Glucagon induziert eine signifikante nukleäre Translokation von FOXO1, nachgewiesen mit einem neu entwickelten, hochsensitiven, GFP-FOXO1 basierten screening System

Fragestellung: Welche Faktoren sind an Modulationen der intrazellulären Translokation von FOXO1 als Mediator u.a. in der Insulin Signaltransduktion beteiligt?

Der Transkriptionsfaktor FOXO1 wird durch Insulin in der Signalkaskade terminal inaktiviert durch AKT/PKB-abhängige Phosphorylierungen, die zu einem nukleären Export und im Zytoplasma zur proteasomalen Degradation führen. FOXO1 aktiviert zentrale Gene der Gluconeogenese (PEPCK, G6Pase) bei Insulinresistenz oder niedrigen Insulinspiegeln. Der Transkriptionsfaktor ist bei zahlreichen zellulären Prozessen beteiligt und induziert bei kurzfristiger Aktivierung antioxidative, protektive Systeme, bei längerfristiger Aktivierung jedoch u.a. eine Störung der mitochondrialen Biogenese, eine Myosin-Schwerkettendegradation via Proteasom Pathway und zahlreiche andere nachteilige Reaktionen. Wir entwickelten deshalb einen sensitiven optischen Assay zur schnellen Analyse der zellulären Regulation von FOXO1.

Material und Methoden: Humanes FOXO1 wurde als Fusionsprotein mit C-terminalem GFP kloniert und sowohl transient als auch permanent in verschiedene Zelllinien transfiziert. Nach Transfektion kam es zu einer ausgeprägten transienten Expression von FOXO1, das intranukleär und zytoplasmatisch lokalisiert war, was eine Analyse sowohl des Imports als auch des Exports aus dem Zellkern erlaubte. Stabile FOXO1-GFP exprimierende U2OS-Zellen wurden kloniert – mit überwiegend zytoplasmatischer Lokalisation -, die zur hochsensitiven Analyse des Imports geeignet waren.

Ergebnisse: Die Stimulation von transfizierten U2OS-Zellen mit Insulin führte zu einem signifikanten Export von FOXO1, der dosisabhängig zwischen 10–1000 nmol/l Insulin darstellbar war. Eine Hemmung der PI3-Kinase mit LY-2940002 oder Wortmannin bedingte eine bis zu 3-fache dosisabhängige Zunahme des nukleären/zytoplasmatischen FOXO1 Quotienten. Glucagon induzierte einen hochsignifikanten nukleären Import bei einer Dosis von 50 nmol/l mit einem P-Wert=0,00015.

Schlussfolgerung: Ein nukleärer Import von FOXO1 durch Glucagon wurde bisher nicht beschrieben. Unser System erlaubt eine hochsensitive Analyse der Regulation von FOXO1 durch unterschiedliche Einflüsse einschließlich einer Dissektion der beteiligten Signalwege.