Diabetologie und Stoffwechsel 2009; 4 - P_285
DOI: 10.1055/s-0029-1222089

Entwicklung eines Chemilumineszenz-Assays (CLIA) zur Messung von sezerniertem Ratten-Proinsulin

N Thomé 1, M Schäfer 1, 2, C Clemm 1, 3, PB Musholt 1, E Weyand 4, MM Weber 4, T Forst 1, 4, A Pfützner 1, 2
  • 1IKFE – Institut für klinische Forschung und Entwicklung, Mainz, Germany
  • 2Fachhochschule Bingen, Bingen-Büdesheim, Germany
  • 3Fachhochschule Bonn-Rhein-Sieg, Rheinbach, Germany
  • 4Universitätsklinik Mainz, Endokrinologie und Stoffwechsel, Mainz, Germany

Fragestellung: Die präklinische Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf die Funktion der ß-Zelle kann die Suche neuer Medikamente zur Behandlung des Diabetes mellitus erleichtern. Bei lediglich begrenzter Verfügbarkeit von humanen Inselzellen können derartige Medikamenten-Studien auch am Ratten-Modell etabliert werden. Dies setzt jedoch die Verfügbarkeit Ratten-spezifischer Hormontests voraus, welche über die Funktionalität der ß-Zelle Aufschluss geben. Unser Ziel war es, einen Ratten-spezifischen intakt Proinsulin Assay zu entwickeln.

Methode: Der Assay zur quantitativen Bestimmung von intaktem Proinsulin basiert auf dem Chemilumineszenz-Prinzip. Es handelt sich um ein “Sandwich“-Immunoassay mit einem immobilisierten Antikörper (gegen das intakte Proinsulin) auf der Mikrotiterplatte und einem löslichen, Acridiniumesther-markierten Antikörper (gegen das C-Peptid). Die Chemilumineszenz wird durch die Zugabe von NaOH und H2O2 und die dadurch resultierende Oxidation von Acridiniumesther induziert und in einem Luminometer ausgewertet. Anhand einer Eichkurve mit bekannten intakt Proinsulinkonzentrationen können die unbekannten Proinsulinkonzentrationen in den Proben errechnet werden.

Der Assay wurde mit drei internen Standards (K1: 350pmol/L=niedrige Konzentration, K2: 2000pmol/L=mittllere Konzentration und K3: 4000pmol/L=hohe Konzentration) auf Intra- und Interassay-Präzision überprüft. Zudem zeigen Wiederfindungsraten die Stabilität des Tests. Es erfolgte weiterhin eine Untersuchung auf Kreuzreaktivität gegen Ratten-Insulin und Ratten-C-Peptid.

Ergebnisse: Der entwickelte Ratten intakt Proinsulin Chemilumineszenz-Assay erwies sich sowohl in der Intraassay- (K1: 348,66pMol±33,88 (CV: 9,72); K2: 2058,39pMol±56,08 (CV: 2,72); K3: 3971,85pMol±96,91 (CV: 2,44)) als auch in der Interassay-Präzision (K1: 328,95pMol±42,01 (CV: 12,77); K2: 1935,92pMol±41,12 (CV: 2,124); K3: 3735,42pMol±58,49 (CV: 1,57)) als valide. Wiederfindungsraten verschiedener gespikter Konzentrationen bewegten sich im Rahmen von 88,2%. Zudem konnte keine signifikante Kreuzreaktivität zu Ratten-Insulin und Ratten-Proinsulin festgestellt werden.

Schlussfolgerung: Zur Untersuchung der Funktionalität von Ratten-Inselzellen wurde ein valider, spezifischer intakt Proinsulin Chemilumineszenz-Assay (CLIA) entwickelt.