Messung der Exozytose von Insulin-Sekretgranula mittels zweier unterschiedlicher Varianten der TIRF-Mikroskopie

Einführung: In den letzten Jahren werden vermehrt mikrofluorimetrische Verfahren (Imaging) angewendet, um ein umfassenderes Bild von der Regulation der B-Zell Exozytose zu gewinnen. Besonders interessant ist die TIRF oder evanescent wave Mikroskopie, da hier nur eine plasmamembrannahe Schicht von 50 bis 200nm zu Darstellung kommt. Die Aussagekraft hängt jedoch stark von methodischen Variablen ab, die bisher nur unvollständig charakterisiert wurden.

Methoden: Insulinsezernierende MIN6 Zellen wurden mit einem Insulin-EGFP Fusionsprotein oder einem IAPP-EGFP Fusionsprotein transient transfiziert und die Reaktion der Granula auf einen depolarisierenden Stimulus mit TIRF-Mikroskopie (Laserwellenlänge 488nm) in der Prismen-basierten und in der Objektiv-basierten Variante registriert.

Ergebnisse: In der Objektiv-basierten TIRF Variante erschienen Insulin-EGFP-markierte Sekretgranula als hell fluoreszierende, gut abgrenzbare Strukturen, so dass geringe Belichtungszeiten von 80–120ms und Aufnahmefrequenzen von 6–8 fps möglich waren. Als Reaktion auf eine K⁺-Depolarisation zeigte sich eine transiente Intensivierung der Fluoreszenz mit nachfolgender Abnahme. Die kurzdauernde Aufhellung kann als Indikatorreaktion für die Exozytose gewertet werden und erklärt sich durch ein vermindertes Quenchen der intragranulären Fluoreszenz vor dem Efflux des granulären Inhalts. Wurde die Prismen-basierte TIRF-Variante mit den gleichen transfizierten Zellen verwendet war die Fluoreszenzintensität so gering, dass die erforderlichen langen Belichtungszeiten die Detektion des transienten Fluoreszenzanstiegs praktisch unmöglich machte. Mit dem IAPP-EGFP Fusionsprotein ließ sich in der Objektiv-basierten TIRF-Mikroskopie eine der Insulin-EGFP entsprechende Darstellung hinsichtlich der Zahl und der Fluoreszenzintensität erreichen. Auch die Reaktion auf die K⁺-Depolarisation war qualitativ entsprechend, jedoch stellte sich die spontane Bewegung der Granula deutlich träger dar.

Schlussfolgerung: Die Messung von Zahl, Beweglichkeit und Exozytosefrequenz von Insulin-Sekretgranula ist in der Objektiv-basierten TIRF-Mikroskopie praktikabel. Die Beobachtungen sind derzeit noch nicht allgemeingültig, da sie von der Auswahl des Labels beeinflusst werden. Die notwendige hohe Aufnahmefrequenz führt zu Datenmengen, die eine vollständige manuelle Auswertung zeitraubend und fehleranfällig machen, was die Entwicklung automatisierter Auswertealgorithmen erforderlich macht.